Т А Ц Г – Т Т А А – Г Т Ц А Г
Рис. 1. Сшивание генов
При отсутствии комплементарных «липких» концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем (коннекторный метод получения гибридных молекул ДНК), используя концевую (терминальную) дезоксинуклеотидилтрансферазу из тимуса теленка или поли(А) – полимеразу E.coli.
Также, для стыковки фрагментов применяют так называемые линкеры (рис. 2) (или «переходники») – короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы:
– А Т Г Ц А А Т Т Ц Т Г А Г А Т Ц Ц А Т А Ц Г
Т А Ц Г Т Т А А Г А Ц Т Ц Т А Г Г Т А Т Г Ц
Фрагмент 1 Линкер Фрагмент 2
Рис. 2. Объединение фрагментов линкерами
Линкерные фрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем, часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.
После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привносят в него новые генетические и физиолого-биохимические свойства, полезные для человека. Но поскольку она не способна к самовоспроизведению, её разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться (интегрироваться) в её геном и реплицирваться за его счет, либо быть способной к автономной репликации. Принято молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и автономно реплицироваться, называть векторными молекулами. К числу векторов относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных. Векторы должны обладать следующими особенностями:
1. Иметь субстратные участки для определенных эндонуклеаз рестрикции.
2. Иметь свойства репликона.
3. Содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придают ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора.
Таким образом, все векторы обеспечивают репликацию встроенных генов, их экспрессию, интеграцию в хромосому клетки и т.д. Чаще других в генетической инженерии в качестве векторов используют плазмиды. Плазмидами называют стабильно наследуемые бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности). Они представляют собой двуцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды); биодеградацию (D-плазмиды) и др. Например, плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и др. Количество плазмид в клетке может колебаться от одной до более ста.
Первый плазмидный вектор был получен С. Коэном (1973). Его источником была плазмида E. coli R6-5 c Mr 65 кДа. Плазмида стала родоначальником серии векторов и других структур.
Плазмида pBR313 содержит уникальные участки расщеплений нескольких рестриктаз (рис. 3).
Рис. 3. Схема использования плазмиды pBR322 для отбора клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды.
Еще по теме:
Методы обучения физике
На уроках физики используются разнообразные методы обучения: рассказ, объяснение, лекция, беседа, демонстрация опытов, иллюстрация рас-сказа моделями, плакатами, рисунками, диапозитивами, телепередачи, звукозапись и видео-запись, учебные кинофильмы, работа учащихся с учебником, справочной и научно- ...
Сравнительный анализ уровня сформированности педагогической культуры
родителей
Целью данного этапа эксперимента является подведение итогов проделанной практической работы по воспитанию педагогической культуры родителей. С этой целью использовалось анкетирование родителей. Анкета была составлена О. Л. Зверевой. В результате проделанной работы увеличился процент родителей, кото ...
Специфика деятельности учреждений социально – культурной сферы в
современной социальной ситуации
Воздействие политических, экономических, социальных, институционных изменений на положение женщин, на их роль, как объектов, так и участников общественного развития всегда было крайне сложным и даже противоречивым. С одной стороны, женщину возводили на пьедестал, видели ее роль главным образом в со ...