Основы генетической инженерии

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту (иммунологический метод Брума–Джилберта). Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации (Грюнштейн – Хогнесс) . (рис. 4).

Рис. 4. Метод радиоавтографии в применении к поиску рекомбинантных клонов.

Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название «шотган» (от англ. shotgun – дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды E.coli, «раскрытые» (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом.

Другой подход, используемый для получения нужных генов, состоит в конструировании на мРНК-матрице комплементарной по отношению к ней ДНК (кДНК) . Теперь специфическую мРНК, кодирующую белок, ген которого надо получить, можно использовать в качестве матрицы для ферментативного синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы). (рис. 5).

После расщепления гибрида ДНК-РНК, используя видоизменённую протеазами ДНК-полимеразу E.coli – фрагмент Клёнова, синтезируют двухцепочечную ДНК.

После расщепления «шпильки» остается синтетическая двуцепочечная кДНК, соответствующая белку, кодируемому интересующим нас геном. Заметим, однако, что если эту синтетическую кДНК получали с эукариотической мРНК, то она не идентична природному гену этого белка, поскольку не содержит ни интронов, т.е. вставочных последовательностей, ни стартовых и терминирующих сигналов, присущих генам большинства эукариотических белков. И для экспрессии такого гена в клетках прокариот необходимо, чтобы он находился под контролем прокариотических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществления экспрессии соответствующая кДНК присоединяется к регуляторным элементам бактерии-промотору, оператору и рибосом-связывающему участку.

На современном этапе также возможен химико-ферментативный синтез полинуклеотидных последовательностей. Синтез гена впервые был осуществлён в 1970 году в лаборатории Х.Г. Кораны.

Рис. 5. Схема подготовки кДНК для клонирования.

Клонирование и экспрессия генов в различных организмах

В настоящее время разработаны системы клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляют системы клонирования генов в грамположительных бактериях, многие из которых являются сверхпродуцентами важнейших химических соединений. Значительных успехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками Bacillus subtilis, стрептомиценами и Sacchromyces cerevisiae.

Еще по теме:

Общее понятие о воспитании, его отличие от обучения
Воспитание является наравне с обучением процессом, в котором происходит усвоение ребенком общественного опыта. В отличие от обучения, связанного с развитием познавательных процессов, способностей, приобретением знаний, формированием умений и навыков, воспитание нацелено на формирование человека как ...

Дидактическая игра как средство формирования лингвистических знаний
Родоначальником теории игры в отечественной науке считается К.Д. Ушинский. Он противопоставляет проповеди стихийности игровой деятельности идею использования игры в общей системе воспитания. Ушинский, ценя двигательную активность ребёнка в игре, на первое место выдвигает потребности души: «Мы не до ...

Практика проведения коррекционно-развивающего обучения в компенсирующем классе
Обратимся к конкретному педагогическому опыту организации коррекционно-развивающего обучения в компенсирующих классах. Современная школьная практика накопила определенный опыт осуществления коррекционно-развивающего обучения, обеспечивающего положительные результаты в образовании и воспитании детей ...

Категории

• Главная
• Обучение детей ориентировке во времени
• Половое воспитание детей и подростков
• Ценности и воспитание
• Работа социального педагога
• Предмет и задачи педагогики
• Теоретические основы воспитания
• Информация о педагогике и образовании
• Карта сайта
• Контакты